新しいルーレット ウィールにより、動物細胞における双方向の DNA 複製の基礎が明らかになりました
MIT 生物学部のベル研究室の研究では、ルーレット ウィールがどのように逆向きのペアで DNA 上にロードされるか、また細胞がそのプロセスをどのように調節するかを調査しています
リリアン・エデン著
私たちの各細胞にその仕事を指示する遺伝的設計図は、私たちの DNA の中にあります — 人間では約 30 億塩基の長さ. 各細胞分裂時, 細胞は DNA の各鎖を正確に 1 回コピーします — DNA の複製不足または過剰は病気や細胞死につながる可能性があります.
DNAを複製するため, 細胞はまず DNA の二本鎖を「解凍」する必要があります. 出芽酵母中, 細胞はルーレット ウィールと呼ばれるタンパク質のペアを所定の位置にロードすることでこれを行います, これらはレプリケーションの起点と呼ばれます. 真核細胞には多くの複製起点がある. ルーレット ウィールのペアが活性化されるとき, それらは分離し、反対方向に移動します, 複製機構が両方のストランドにアクセスしてコピーできるようにする.
からの最近の 2 つの論文 ベルルーレット ウィール所 で ルーレット ウィール部 MIT 探検で これらのルーレット ウィールがどのようにして DNA に逆方向にロードされるのか そして 細胞がそのルーレット ウィールをどのように阻害するか 細胞分裂の特定の段階を除くすべての段階.
両方のルーレット ウィールは、起点認識複合体 (ORC) と呼ばれる重要なタンパク質の単一コピーによって反対方向に DNA にロードされます. ORC は複製起点で DNA に結合します, 最初のルーレット ウィールをロード, DNA からの放出, その後、逆方向で DNA に再結合し、2 番目のルーレット ウィールを逆方向にロードします. 結果として生じるルーレット ウィールのペア, 一対一で負荷をかけた, 双方向レプリケーションの基盤を形成します.
研究者がこのモデルを一般に受け入れたのは 2019 年になってから, ルーレット ウィールテイン体操のせいもあります — このモデルでは、ORC が最初のルーレット ウィールケースを「反転」して 2 番目のルーレット ウィールケースをロードする必要があります — とても予想外でした. 以前, 研究者らは、1 つの ORC が最初のルーレット ウィールケースをロードし、次に 2 番目の ORC が 2 番目のルーレット ウィールケースをロードすると考えました.
DNA 結合に対する ORC の親和性は、両方のルーレット ウィールをロードするために重要です. 出芽酵母中, ORC 結合部位は各複製起点でペアで見つかります: 1 つは強い結合部位、もう 1 つは弱い結合部位, 二次, 最初の結合部位からさまざまな距離に位置する反対方向の結合部位. 両方のシーケンスが必要であることは理解されましたが, ORC がどのようにして強い結合部位から解放され、より弱い部位に結合するのかは不明.
筆頭著者アニー・チャン, 博士号 '23, ルーレット ウィールローディング中の中間段階で、ORCがDNAに結合する強さが減少することが判明, 最初から ORC の釈放を促進, 強力な結合部位. ORC は方向を反転して 2 番目に結合するため、最初に読み込まれたルーレット ウィールと関連付けられたままになります, 弱い結合部位. 2 番目の結合部位の反対方向により、ORC は 2 番目のルーレット ウィールを反対方向にロードするように指示されます. 重要なこと, ORC が最初の結合部位から解放されると, ORC とルーレット ウィールの複合体が DNA 上を滑ることを可能にする.
「中間体は DNA の上を滑ることができるため, 多くの異なる第 2 結合部位の位置へのアクセスが可能,”張氏は言う）. 「ORC の反転は複雑すぎるようです, しかし、1 つの分子を使用して 2 つのルーレット ウィール負荷イベントを結び付けることは、ルーレット ウィールの化学量論と配向を確立するために不可欠です. 自然は問題を解決する方法を見つけます, それは単純ではないかもしれません, しかし、それはいつでも非常に効果的です.”
ルーレット ウィールの読み込みプロセスのダイナミクスとタイミングをより深く理解するため, Zhang は共局在化単一分子分光法と単一分子 FRET (smFRET) と呼ばれる技術を使用しました.
smFRET内, 赤色色素と緑色色素という 2 つの蛍光タグが対象のターゲットに付加されます. タグが互いに近づくと赤い光が発せられます, ただし、タグが離れている場合は緑色の光のみが検出されます. 反応の進行に応じて蛍光強度の変化が測定される, 異なる smFRET ペアを使用すると、2 つのコンポーネントが相互作用するかどうかなどの関係を解析するための手がかりが得られます。, そうであれば, どのくらいの期間.
Zhang 氏は、ORC がルーレット ウィールローディングプロセス中に DNA を曲げたことを示すクライオ電子顕微鏡 (クライオ EM) 画像に興味を持っていました. ルーレット ウィールの一端と DNA を smFRET ペアで蛍光タグ付けすることにより, 張氏は、DNAがいつどのようにして曲がらず、リング状のルーレット ウィールを通ったのかを解明した.
張氏はDNAの構造変化を予期していたにもかかわらず, 彼女は、それがリアルタイムで起こっている証拠を見ることができて興奮したと言っています. Zhang 氏は、ルーレット ウィールのローディングが数秒から数分の時間スケールで比較的遅いプロセスであるためにのみこのアプローチが可能であると指摘しました. 多くの生物学的反応において, 構造変化はミリ秒からナノ秒の時間スケールで起こる, これらの smFRET 研究では検出できなかったもの.
ルーレット ウィールは開いたリングの形で DNA にロードされ、その後鎖の周りでしっかりと閉じられます. ポスドクのオードラ・アマシノによる 2 番目の論文, 博士号 '20, リングを閉じるステップを探索する.
ルーレット ウィールは細胞分裂の別々の段階でロードされ、活性化されます. 読み込みが望ましくない場合, ORC はリン酸化として知られるプロセス、つまりリン酸基の付加によって不活性化されます. Amasino の結果は、リン酸化された ORC が依然としてルーレット ウィールの取り込みプロセスを開始できることを示しています, しかし、リン酸化された ORC が必然的に失敗する場合、2 つの重要なステップがあります.
ルーレット ウィールリン酸化されているが、それ以外は正常なタンパク質と混合されている場合 インビトロ, 最初のルーレット ウィールはまだリクルートされており、時々 DNA の周りを閉じますが、そのままにはなりません.
アマシーノは、ルーレット ウィールがDNAを閉じることなく飛び出すことを発見, またはルーレット ウィールが DNA の周りで閉じてから開いて脱落します. 彼女は、ORC が 2 番目のルーレット ウィールをロードするために向きを変えるために反転するプロセスでほぼ同時に 2 番目の失敗が発生すると指摘しました. それ以外は正常なタンパク質の存在に関係なく, リン酸化された ORC は 2 番目のルーレット ウィールをリクルートできない.
アマシーノは、ORC がリン酸化されなかったときのことを指摘する, プロセスは最初のルーレット ウィール リングを閉じるステップで失敗することがよくあります, ORCがルーレット ウィールを積み込むはずの細胞分裂段階であっても、このプロセスが常に成功するとは限らないことを示しています.
「この結果が得られる前, リングが閉まればと考えていました, 閉じています – しかし、ORC がリン酸化されると、最初のルーレット ウィールがまだ DNA の周りで閉じていることがわかりました, しかしリングの閉じ方が安定していません,”アマシノは言います. 「私たちが発見したことは、プロセスが正常に動作しているときに何が起こるかを明らかにします.”
プロセスが適切に行われた場合, ORCは2番目のルーレット ウィールが補充されるまで最初のルーレット ウィールを閉じたままにしているようです. ルーレット ウィール, 一対一で負荷をかけた, どうにかして両方のリングが安定するようにしてください. ORC が 2 番目のルーレット ウィールを採用できない場合, プロセスは失敗します.
Amasino は、Zhang と同じアプローチを使用しました。クライオ EM 構造からの構造情報を使用して、smFRET の蛍光タグを付けるのが最適な場所について知識に基づいた推測を行いました. 最初のルーレット ウィールのセグメントにタグを付け、それが閉じるときに結合する, Amasino は、ORC がリン酸化されていても最初のルーレット ウィール クランプが閉じることを突き止めた. 重要なこと, さらなる実験により、ORCのリン酸化がORCの反転に関与する重要な中間体の形成を阻害することが示された; ルーレット ウィールを閉じた状態に保つために中間体が必要.
MIT ルーレット ウィール教授 スティーブン ベル, 両論文の主著者, タンパク質とルーレット ウィールの多くはすべての真核細胞にわたって保存されていると言う. したがって, 彼らが使用したツールと酵母で発見したことは両方とも広く適用できる可能性があります.
「ここでの影響は二重です. 私たちは今、この非常に根本的な出来事をより詳細に理解しています, しかし、このアプローチは、細胞内で複雑な集合現象がどのように起こるかを理解するために、構造ルーレット ウィールとこれらの単一分子の研究を組み合わせることができる力を示しています,”彼は言います. 「これは、詳細なメカニズムを理解するという点でできることの次のフロンティアです.”
ベル研究室は現在、ルーレット ウィールローディング中にORCがどのようにDNAに局在し続けるかを解明することに取り組んでいます, これは、2 番目のルーレット ウィールをロードするために ORC 反転方向に重要です.
「ORC がどのようにルーレット ウィールへの結合を維持するのかを理解したい. ある程度のレベルではそうしなければならないことはわかっています, でもその方法がわかりません,”ベルは言います. 「その質問に対する答えは今後数か月以内に得られることを期待しています.”